人体老化是一个极其复杂的过程，会受到多种因素的共同作用。随着人类寿命的延长，老年疾病的发病率也在不断地增加。

越来越多的研究表明，表观遗传学信息的丧失，可能是哺乳动物衰老的一个重要原因。那么，具体有哪些已被证实的证据呢？机制又是怎样的呢？

【资料图】

近日，来自哈佛医学院的科学家及合作者在《Cell》发表了题为“Loss of epigenetic information as a cause of mammalian aging”的研究论文，结果发现：忠实的DNA修复行为在生理、认知和分子水平上促进衰老，包括表观遗传状态的侵蚀、细胞外分化、衰老和DNA甲基化时钟的推进，这可以通过OSK（即山中因子）介导的再生来逆转。

一、研究背景

表观遗传学研究是指，在基因组DNA序列没有改变的情况下，细胞调控基因表达的方式。在哺乳动物中，表观遗传学调控的失衡已被证明与许多疾病的发生有关，但其与哺乳动物衰老之间的关系仍存在争议。

二、研究方法

图注：研究摘要图。（来源：Yang, J., et al. 2023）

1、实验模型和实验对象

研究人员生成了I-PpoISTOP敲除小鼠ES细胞，开发了一个诱导表观遗传衰老（ICE）的系统，该系统由I-PpoI基因与三苯氧胺（TAM）调节的突变雌激素受体结构域基因（ERT2）的C末端、转录loxP-STOP-loxP盒和全身表达泛素启动子上游TAM调节的Cre重组酶基因（Cre-ERT2）的融合组成（下图左上角）。

在TAM存在的情况下，Cre-ERT2切除终止盒，促进ERT2-HA-I-PpoI-IRES-GFP盒的转录，该盒产生核定位的ERT2-I-PpoI，在去除TAM后降解。

图注：具有TAM诱导I-PpoI核酸内切酶的ICE系统。（来源：Yang, J., et al. 2023）

在第E13.5天从小鼠胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），并在低氧（3%v/v）中培养。在解剖出子宫和卵黄囊后，将胚胎转移到含有无菌PBS的新培养皿中。取出肝脏、心脏、头部，剩余部分在无菌PBS中洗涤去除血液。将胚胎在0.25%胰蛋白酶-EDTA中切碎，并在37℃下孵育30分钟。用MEF生长培养基洗涤并维持细胞。

2、Western印迹、Southern印迹分析

使用标准流程对细胞和组织样品进行蛋白质免疫印迹分析，以及基因组DNA的Southern印迹分析。

3、Surveyor分析和MEF的代谢标记

使用侧翼引物组的PCR，从Cre或ICE细胞分离的基因组DNA中扩增I-PpoI靶区。在热循环器中杂交异源或同源双链体，并用SURVEYOR核酸酶S在42ºC下处理杂交DNA 60分钟。停止核酸酶反应，并通过琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪分析。

使用脉冲标记培养基将MEF洗涤两次，并在脉冲标记培养液中孵育1小时以耗尽细胞内蛋氨酸。将含有0.2mCi/ml甲硫氨酸[35S]的脉冲标记培养基加入细胞中并孵育1h。裂解细胞，并通过TCA沉淀和闪烁计数测定35S甲硫氨酸掺入。

4、蛋白质合成的定量及DSB的定量

混合L-3H-苯丙氨酸（1mCi/mL）与未标记的苯丙氨酸（135mM）。用NaOH将溶液调节至pH7.1后，在氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉下，从尾侧静脉以1ml/100g体重注射标记溶液，对蛋白质合成进行定量。

使用先前的流程检测I-PpoI产生的DNA双链断裂（DSB）。

5、间接量热法及MMQPCR

使用Columbus Instruments CLAMS测量食物消耗、活动能力、耗氧量（VO2）、二氧化碳生成量（VCO2）和呼吸交换率（RER）。

用SYBR Green系统制备含有20ng基因组DNA的PCR反应，对Hbbt1扩增进行信号采集，进行单色多重定量PCR。

6、脆弱指数评估、晶状体不透明度评分、磁共振成像

如前所述，脆弱指数（FI）是根据缺损的严重程度，对表皮、身体/肌肉骨骼、耳垂/鼻腔、消化系统/泌尿生殖系统和呼吸系统的29个项目进行评分，并测量了体重、体温。对股骨进行微型CT。

图注：ICE小鼠正常衰老表型的实验设计。（来源：Yang, J.,et al. 2023）

晶状体不透明度评分如前所述。将小鼠在在暗室中使用裂隙灯进行评估。用2%异氟烷氧气麻醉小鼠，并将其置于4.7特斯拉Bruker Pharamscan磁共振成像仪中。

7、视神经轴突的定量，小鼠皮肤和大脑的免疫组织化学

解剖视神经并在Karnovsky试剂（50%磷酸盐缓冲液）中固定过夜。在眼球后1.0mm处取神经的半薄横截面，并用1%对苯二胺（PPD）染色，通过光学显微镜进行评估，使用ImageJ软件对轴突进行计数。

用4%多聚甲醛/PBS固定背部皮肤样品，将固定的皮肤样品包埋在OCT中，并在液氮中快速冷冻，进行组织学检查。分析每只小鼠（n=8）100+个毛囊突起中是否存在KIT+黑素细胞。将皮肤组织固定在福尔马林中，包埋在石蜡中，切割5mm切片并用苏木精和伊红染色，量化表皮下厚度。

固定大脑样品，使用与Alexa Fluor 488或594缀合的第二抗体孵育，然后进行DPAI染色。

图注：ICE小鼠大脑衰老表型的实验设计。（来源：Yang, J.,et al. 2023）

8、ATP和mtDNA测量，COX和毛细血管密度染色

用PBS短暂洗涤快速冷冻的组织，匀浆并离心后，将细胞裂解物加入等量的TE饱和苯酚中，将氯仿和水加入同一管中。离心后，将上清液用于ATP和mtDNA的测量。

将新鲜分离的股四头肌和腓肠肌置于OCT并进行异戊烷浴，在液氮中缓慢冷却。进行切片处理和孵育后，根据方案进行COX染色，使用ImageJ对毛细管数和密度进行定量。

图注：ICE小鼠肌肉衰老表型的实验设计。（来源：Yang, J.,et al. 2023）

9、行为学试验

对小鼠进行情境恐惧条件测试、巴恩斯迷宫测试、握力测试、跑步机测试和乳酸测量，并对跑步机步态进行分析。

10、小分子驱动的神经元重编程，测序和数据分析

如前所述进行神经元重编程。将MEF转移到涂有Matrigel的平板上。在切换到Neurobasic培养基后的第2天进行qPCR以检测神经元基因激活，并在第13天进行TUJ1免疫细胞化学。

对Thy1.2+和Calcein Blue+ RGS进行RNA测序，对MEF进行ChIP测序，从快速冷冻的细胞或组织中分离出基因组DNA进行全基因组测序。使用FastQC、SAMtools等对数据进行分析。

图注：表观遗传学重编程恢复年轻的表观遗传学标记。（来源：Yang, J., et al. 2023）

三、研究结果

研究表明，DNA甲基化水平的下降导致了表观遗传学信息的丧失，进一步导致了老年小鼠中基因表达的变化。通过一系列实验研究，科学家们发现，表观遗传学信息的修复可以延缓哺乳动物的衰老过程，并改善细胞功能和健康状况。

研究还发现，表观遗传学信息的丧失，会导致老年小鼠中某些基因的表达水平变得不稳定，包括调控细胞周期和凋亡的基因。

四、总结

该研究为恢复细胞活力，控制衰老提供了新的思路。尽管取得了一定的进展，但是目前仍有许多问题需要进一步解决。例如，如何更好地恢复丧失的表观遗传学信息，以及如何将这些治疗方法应用于人类等等。

Sinclair教授指出，研究目的不仅是解决衰老，还包括衰老相关的疾病。一个人不仅可以活着，还需要保持健康，这才是终极目的。

参考来源：

Yang, Jae-Hyun, et al. "Loss of epigenetic information as a cause ofmammalian aging." Cell (2023).

撰写：乐乐吖